酵素

食品衛生検査への応用

従来の食品衛生検査法は培養の操作を含むため、数日間から1週間程度の日数がかかり、検査期間の短縮化が求められていました。ホタルの発光酵素ルシフェラーゼを用い、全ての生物にエネルギー物質として含まれるATP(アデノシン三リン酸)を微生物や汚れの指標として測定するATP法は、簡便・迅速な測定が可能です1)。ATP法は、2004年に厚生労働省監修の食品衛生検査指針にも収載された食品衛生検査法です2)

ルシフェラーゼの発光原理と改良

ルシフェラーゼはATP量に依存して発光するため、光の強さを測ることで迅速かつ高感度にATP量を測定できます(図1)。当社では、1980年代にルシフェラーゼの研究に着手し、ゲンジボタルとヘイケボタルのルシフェラーゼを「スリーパーベクター」により大量生産することに成功しました。また、野生型のルシフェラーゼは熱や化学物質に対して不安定でしたが、臨床診断用酵素開発で培った酵素改良技術を用い、熱や界面活性剤に対して安定なルシフェラーゼの開発に成功しました(図2、3)。現在、これら改良型ルシフェラーゼを用いた製品開発が進んでいます。

図1. ATPの検量線(RLU:Relative Light Units)

図1. ATPの検量線(RLU:Relative Light Units)

図2. 耐熱性の向上  50℃での残存活性を比較した。30分の処理で野生型の残存活性は数%であったのに対し、LlL-217Leu変異体は90%以上の残存活性を示した。

図2. 耐熱性の向上

50℃での残存活性を比較した。30分の処理で野生型の残存活性は数%であったのに対し、LlL-217Leu変異体は90%以上の残存活性を示した。

図3. 界面活性剤耐性の向上  0.1%塩化ベンザルコニウム存在下で、発光の経時変化を測定した。界面活性剤耐性変異体は、安定な発光を示した。

図3. 界面活性剤耐性の向上

0.1%塩化ベンザルコニウム存在下で、発光の経時変化を測定した。界面活性剤耐性変異体は、安定な発光を示した。

ATP+ADP+AMPふき取り検査法(A3法※)

微生物や食品残渣などの汚れにはATPが存在しているため、ルシフェラーゼを用いれば汚れの量を迅速に測定できます。
 しかし、発光の過程でATPはエネルギーを失ってAMP(アデノシン一リン酸)となるため、反応に伴い発光が弱くなってしまいます。そこで、AMPをATPに再生する酵素の探索を行い、PPDK(ピルビン酸リン酸ジキナーゼ)と呼ばれる酵素を見出しました。PPDKとルシフェラーゼを組み合わせ、ATPをサイクリングするシステムの構築にも成功し、従来よりも高い発光を安定に持続できるようになりました(図4)。この技術の応用により、従来よりも小型で安価な測定機でも光を検出できるようになり、食品製造工場、給食調理施設、保健所などを含め、使用するフィールドが広がりました。
 また、ATPは酵素や加熱や長期間の保存などの影響でも、ADP(アデノシン二リン酸)、さらにはAMP(アデノシン一リン酸)に分解されてしまいます。そこで、ルシフェラーゼにPPDKとPK(ピルビン酸キナーゼ)を組み合わせ、ATPだけでなくADP、AMPも同時に測定できる方法を開発しました(図5)。
これらの技術を応用したATP+ADP+AMPふき取り検査法(A3法)(図6)は、より幅広い汚れを検出できる方法として、さらにフィールドを広げています。

※A3法は、キッコーマン独自の呼称です。

図4. ATPのサイクリングとその効果

図4. ATPのサイクリングとその効果

図5. ATP+ADP+AMP測定原理

図5. ATP+ADP+AMP測定原理

図6. ATP+ADP+AMPふき取り検査(A3法)システム「ルシパックA3」と測定器「ルミテスターPD-30」

図6. ATP+ADP+AMPふき取り検査(A3法)システム「ルシパックA3」と測定器「ルミテスターPD-30」

微生物検査

ATP法によって微生物量を測定するためには、汚れなどに含まれるATPを前処理によって分解し、微生物内に存在するATPだけをルシフェラーゼと反応させる必要があります。当社では、微生物の外に存在するATPを、2種類の酵素を組み合わせて効率的に分解する方法を開発しました。この前処理法と、独自の微生物ATPの抽出法を組み合わせ、30分程度の操作で微生物を測定できる方法を開発しました(図6)3)

ところで、この方法を様々な飲料や食品に適用すると、食品由来のATPが十分に分解できず、バックグラウンドが高くなることがわかりました。そこで、前述の酵素と界面活性剤を組み合わせた前処理法を開発し、現在では乳製品や果汁、缶飲料、PETボトル飲料などの微生物検査が可能となっています(図7)。

図6. 微生物の検量線

図7. バックグラウンド発光の低減化

各種食品向けに開発した前処理法により、バックグラウンドを1/10以下にまで低減化することができた。

「ホタルルシフェラーゼの応用開発」は2004年に日本農芸化学会農芸化学技術賞を受賞しました。

引用文献

1

村上成治ほか:ホタルルシフェラーゼの応用開発,日本農芸化学会誌,78(7),630-635(2004)

2

社団法人 日本食品衛生協会,第2章 細菌,食品衛生検査指針,71-74,122(2004)

3

Hattori, N. et al.: Enhanced Microbial Biomass Assay Using Mutant Luciferase Resistant to Benzalkonium Chloride, Anal. Biochem., 319, 287-295 (2003)